(圖片可連結至iGEM Wiki)

為什麼我們選擇肺癌
癌症長期以來一直是現代人群死亡的主要原因。
根據中華民國（台灣）衛生福利部統計，2020年共有50,161人死於癌症，佔全部死亡人數的36.6%（衛生福利部，2020） 。

在癌症造成的死亡中，18% 是由肺癌造成的，比其他癌症都要多。因此，這是我們要優先解決的問題。
回顧肺癌的相關數據，我們發現這種現象並非台灣獨有。從全球來看，2020年，肺癌在所有癌症類型中死亡率最高。

肺癌造成如此嚴重影響的主要原因可能有兩個：早期難以發現，晚期甚至手術後也容易發生轉移。

早期發現的困難主要是由於早期肺癌的非特異性症狀，包括咳嗽、胸痛和氣短，這些症狀通常被視為呼吸道症狀。
因此，許多肺癌患者可能只有在因轉移癌症狀就醫時才發現自己患有原發性肺癌。
儘管檢測器可能無法識別早期肺癌細胞，但我們仍然可以透過宣傳和教育人們健康習慣來彌補它。

更重要的是，導致治療困難的關鍵因素是癌症的轉移傾向。
一旦肺癌細胞擴散到多個器官，情況對醫生來說就變得極具挑戰性。術後追蹤不充分導致的癌症轉移也會導致嚴重的問題。
我們相信，透過專注於檢測肺癌轉移，特別是手術後不可預測的轉移，可以取得進展。
 

透過循環腫瘤細胞 (CTC) 檢測來檢測轉移
肺癌轉移的一個重要特徵是血液中出現循環腫瘤細胞（CTC）。 CTC 可以離開原發癌症的區域，進入循環系統，並轉移到其他器官。
當血液中檢測到≥5個CTC時，就被認為是癌症轉移的高風險（Cristofanilli, M. et al. 2004）。

檢測CTC的主要方法是使用單株抗體，其具有特異性高的優點，螢光染料與檢測裝置（如流式細胞儀）的結合可以進一步增強檢測的靈敏度。
但單株抗體也有缺點：抗體的製備、儲存和運輸成本較高，導致檢測價格較高（Paoletti, C. et al. 2016）；而且檢測設備價格昂貴，只有城市醫院或體檢中心才能負擔得起，降低了檢查的便利性。這兩個缺點阻礙了CTC檢測的普及和標準化。

因此，我們開展了CTC-FAST項目，以開發一種更容易取得且負擔得起的CTC檢測技術，以密切、快速地監測癌症轉移。我們的目標是透過密切監測CTC的出現來檢測肺癌細胞轉移，並立即開始治療，以降低肺癌的高死亡率。

以 DNA 四面體取代基於抗體的檢測
為了使 CTC 檢測變得經濟實惠，我們決定使用 DNA 分子從血液樣本中捕獲 CTC。
應用DNA作為捕獲平台的優點包括：
DNA可以在室溫下脫水和保存，從而消除了運輸和保存過程中的低溫需求。
DNA合成的成本明顯低於抗體。

由於葉酸受體α（FRα）富集在肺癌CTC的細胞膜上，且葉酸（FA）與FRα具有高親和力，因此FA綴合的DNA將是一個很好的起點。
為了使FA 綴合的DNA 足夠堅硬，以抵抗CTC 捕獲和標記過程中的剪切力，我們決定將FA 綴合在DNA 四面體上，而不是線性雙股DNA (dsDNA) (Xie, N. et al. 2017 ）。
 

用於 CTC 捕獲的 DNA 四面體的設計
在第一個設計中，我們使用四個獨立的單股DNA（ssDNA）以互補的方式組裝DNA四面體。
每條邊的長度為 17 bp，匝數（四面體的端點）為 2 bp。其中一個 ssDNA 在 5' 末端有 14 個額外的核苷酸，這將在四面體的一個端點形成突出端。
FA 綴合在與該延伸互補的接頭 ssDNA 上。這種設計還能夠實現 FA 與其他 DNA 適體的交換，
這將使我們能夠修改我們的設計，以便將來檢測其他癌症的 CTC。
 

合成生物學對 DNA 四面體的改進
組裝DNA四面體後，我們發現成功率並未達到預期。單獨的單股DNA有中等可能性透過四面體之間的互補形成多面體。
因此，我們的目標是優化DNA四面體的組裝方法。

為了盡量減少分離的單股DNA形成多面體的可能性，我們決定將分離的單股DNA融合成一個連續的單股DNA。
這些連續的單股DNA，即四面體單股DNA，必須穿過四面體的每條邊兩次，最終終止於四面體的一個具有短懸垂的頂點（Youli, J. et al. 2021）。

此外，此四面體必須固定在檢測室的壁上以捕獲 CTC。因此，我們將鋅指蛋白（ZFP）PBSII和Zif268固定在偵測室壁上，
並將對應的辨識基序插入到距離FA綴合端點最遠的兩個邊緣，以確保FA面指向偵測室（Conrado ，RJ et. al.，2012）
為了從 DNA 四面體-葉酸中釋放捕獲的 CTC，我們將反式自動剪接序列引入與葉酸和 DNA 四面體綴合的接頭 ssDNA 上。
加入鋅離子後，反式自動剪接序列會自動裂解。

由於公司很難產生具有高度互補序列的長單股DNA來進行概念驗證，因此我們首先採用體外滾環擴增（RCA）（Li, C. et al. 2023）來產生四面體單股DNA。
為了將長 ssDNA 拼接成單獨的四面體 ssDNA，我們在四面體 ssDNA 的側翼添加了順式自動剪接序列（Youli, J. et al. 2021）。加入鋅離子後，順式自動剪接序列會自動裂解。

但在訪問專業人士後得知，RCA會產生高濃度的ssDNA，容易形成多面體。
為了改善這種情況，我們決定應用滾環複製（RCR）（Hao, M., et al. 2020）在細菌中產生圓形四面體 ssDNA。
此外，為了減少四面體單股DNA之間的相互作用，我們設計共表達單股DNA結合蛋白（SSB）。

為了活化大腸桿菌中的 RCR，我們表達了複製起始蛋白 (RepA)，可辨識起始基序 RCORI105 和終止基序 RCORI65，並將插入序列轉錄為環狀 ssDNA。
環狀四面體 ssDNA 透過 SSB 進行保護和純化。最後，添加鋅離子以誘導純化的圓形四面體 ssDNA 的順式自動剪接和四面體的組裝。

建立用於 CTC 捕獲、標記和檢測的自動設備
為了提高CTC檢測的便利性，我們決定開發一種用於CTC捕獲和後續定量的自動化設備。此裝置的設計將由下列組件組成，如圖所示：
 

週邊血單核細胞（PBMC）室：純化的PBMC將暫時儲存在該室中。
檢測室：用於捕獲 CTC 的 FA 共軛 DNA 四面體的主要位置。
mGL-C7儲存室：專門針對CTC細胞的mGL-C7將儲存在這裡。
反式自動剪接ssDNA誘導劑儲存室：反式自動剪接ssDNA誘導劑將用於降解DNA四面體並釋放用mGL-C7標記的CTC。
廢液儲存室：儲存捕獲和洗滌過程中產生的廢液。
微通道：連接各個腔室的微型通道。
蠕動幫浦：作為推動清洗液和PBMC樣本的動力來源。
等滲溶液儲存室：儲存等滲溶液以用於清潔和緩衝目的。
CTC定量儀。

CTC-FAST 設備的操作
整體檢測流程如下：首先，醫護人員採集7.5ml血樣，以梯度密度離心法（即Ficoll分離）分離出含有CTC的PBMC層。
然後將PBMC注入PBMC室，蠕動幫浦驅動等滲溶液稀釋樣品。然後稀釋的 PBMC 樣品經由蠕動幫浦進入檢測室。
室壁上的 FA 結合 DNA 四面體捕捉血液中存在的 CTC 和巨噬細胞。未捕獲的細胞用過量的等滲溶液洗掉，將它們引導至廢液儲存室。

接下來，將能夠特異性標記CTC的mGL-4A-C7螢光蛋白引入檢測室進行染色。
用等滲溶液洗去多餘的 mGL-4A-C7 螢光蛋白後，注射反式自動剪接 ssDNA，降解 DNA 四面體並釋放染色的 CTC。
最後，將含有CTC的溶液從檢測室輸送至CTC定量儀器進行分析。
在定量過程中，微通道的特性有助於控制樣品流量，並提高檢測的準確性和效率。

CTC定量儀採用光電探測器原理進行檢測。發射波長為488 nm的雷射來激發mGL-4A-C7，然後mGL-4A-C7發出波長為503 nm的光。
光電探測器對 503 nm 波長敏感，將發射的光轉換為特定的訊號強度。最終，mGL-4A-C7 標記的 CTC 的存在是根據特定訊號強度確定的。

肺癌預防的社會面

透過開發CTC-FAST設備，我們將有效提高CTC檢測水平，並有助於降低肺癌的高死亡率。

為進一步減少肺癌死亡人數，我們將重點放在肺癌預防上。根據我們的街頭調查，我們發現大眾對肺癌的認識缺乏，這成為我們教育的主要目標。

我們從「藥食同源」的概念出發，以中醫為基礎。我們與學校食堂合作，面向我校本科生推出“健康便當護肺”，分享護肺食材。

然後我們決定將範圍擴大到當地年輕人。我們組織了開放實驗室活動，介紹了肺癌防治知識以及合成生物學知識。

接下來，針對老年人，我們組織了一場題為“你了解肺了嗎？～國際肺癌日健康教育推廣”的活動，並邀請了當地的老年人。透過本次活動，可以向高危險年齡層分享肺癌防治知識。

最後，我們針對各個年齡層的公眾，在社群媒體上發布了相關的癌症預防資訊。我們為國際友人寄了明信片，背面附有防癌知識。

我們希望透過CTC-FAST改善與肺癌轉移檢測相關的技術問題，同時透過我們團隊組織的活動增加大眾對癌症預防和治療的認識，最終達到降低肺癌死亡率的目的。

參考文獻：
Ministry of Health and Welfare (2021). Analysis of Mortality Statistics for the Year 2021 (Including Appendices). Retrieved May 18, 2023, from https://www.mohw.gov.tw/cp-16-70314-1.html

World Health Organization (2020). Estimated number of deaths in 2020, World, both sexes, all ages. Retrieved May 14, 2023

Cristofanilli, M. et al. (2004). Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine, 351(8), 781–791. https://doi.org/10.1056/NEJMoa040766

Paoletti, C., & Hayes, D. F. (2016). Circulating Tumor Cells. Advances in experimental medicine and biology, 882, 235–258. https://doi.org/10.1007/978-3-319-22909-6_10

Xie, N. et al. (2017). DNA tetrahedron nanostructures for biological applications: biosensors and drug delivery. The Analyst, 142(18), 3322–3332. https://doi.org/10.1039/c7an01154g

Hao, M., et al. (2020). Dynamic Genome Editing Using In Vivo Synthesized Donor ssDNA in Escherichia coli. Cells, 9(2), 467. https://doi.org/10.3390/cells9020467

Jia, Y., et al. (2021, April 8). DNA-Catalyzed Efficient Production of Single-Stranded DNA Nanostructures. ScienceDirect. https://doi.org/10.1016/j.chempr.2020.12.001

Conrado, R. J., et al. (2012). DNA-guided assembly of biosynthetic pathways promotes improved catalytic efficiency. Nucleic acids research, 40(4), 1879–1889. https://doi.org/10.1093/nar/gkr888

Li, C., et al. (2023). Construction of rolling circle amplification products-based pure nucleic acid nanostructures for biomedical applications. Acta biomaterialia, 160, 1–13. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.02.005

Hao, M., et al. (2020). Dynamic Genome Editing Using In Vivo Synthesized Donor ssDNA in Escherichia coli. Cells, 9(2), 467. https://doi.org/10.3390/cells9020467

Chandrupatla, H. et al. (2019). The folate receptor β as a macrophage-mediated imaging and therapeutic target in rheumatoid arthritis. Drug delivery and translational research, 9(1), 366–378. https://doi.org/10.1007/s13346-018-0589-2

Xing, L., et al. (2018). Identification of a peptide for folate receptor alpha by phage display and its tumor targeting activity in ovary cancer xenograft. Sci Rep 8, 8426. https://doi.org/10.1038/s41598-018-26683-z